Anaerobi so bakterije. Značilnosti anaerobov, metode razvrščanja in gojenja

Najbogatejša skupina organizmov po številu in raznolikosti presnovnih poti so prokarioti. Nekateri uporabljajo aerobno respiracijsko shemo, ki je značilna za večino evkariontov, da sintetizirajo ATP (glavno energijsko "valuto" celice). Mikroorganizmi, ki nimajo tega mehanizma, se imenujejo anaerobi. Te bakterije so sposobne proizvajati energijo iz kemičnih spojin brez kisika.

Anaerobna klasifikacija

Glede na kisik ločimo dve skupini anaerobnih bakterij:

• neobvezno - lahko prejema energijo s kisikom ali brez njega, prehod iz ene vrste metabolizma v drugo je odvisen od okoljskih razmer;
• obvezno - nikoli ne uporabljajte O ₂ .

Pri fakultativnih anaerobih je presnova brez kisika pomembna in bakterije se zatekajo k njej le kot zadnjo možnost, ko se sprosti v anaerobno okolje. To pojasnjuje dejstvo, da je dihanje kisika veliko bolj energetsko koristno.

Druga skupina anaerobov nima biokemičnega mehanizma uporabe O ₂ za oksidacijo spojin, prisotnost tega elementa v okolju pa ni le koristna, ampak tudi strupena.

Obstaja več vrst obveznih anaerobov, ki se razlikujejo po odpornosti na prisotnost molekularnega kisika:

• huda smrt tudi pri nizkih koncentracijah O2;
• zmerno hudo, značilno srednje ali visoko odpornost na prisotnost kisika;
• Aerotolerant - posebna skupina prokariotov, ki ne le preživeti, temveč rastejo tudi v zraku.

Razmerje med določeno bakterijo in kisikom lahko določimo z naravo njene rasti v debelini hranilnega medija.

Aero-tolerantni mikroorganizmi vključujejo mlečne kislinske bakterije. Nekatere vrste (npr. Clostridium) so lahko odporne na visoke koncentracije kisika zaradi tvorbe endospor.

Anaerobna energetska presnova

Vsi anaerobi so tipični kemotrofi, ker kot vir energije uporabljajo energijo kemičnih vezi. V tem primeru so lahko donatorji energije organske snovi (kemoorganotrofija) in anorgansko (kemolitotrofija).

Anaerobne bakterije imajo dve vrsti presnove brez kisika: dihanje in fermentacijo. Temeljna razlika med njimi je v mehanizmu asimilacije energije.

Tako se pri fermentaciji energija najprej shrani v fosfogeni obliki (na primer v obliki fosfoenolpiruvata), nato pa s sodelovanjem citosolnih dehidrogenaz pride do fosfoliranja substrata ADP. Elektroni se prenesejo v endogeni ali eksogeni akceptor, ki postane stranski produkt procesa.

V respiratornem metabolizmu se energija shrani v specifično spojino - Pmf, ki se bodisi takoj uporabi za celične procese, bodisi dobavi v membransko usmerjeno električno transportno verigo, kjer se sintetizira ATP. Samo, v nasprotju z aerobno dihanje, končni akceptor elektrona ni kisik, ampak druga spojina, ki je lahko organske in anorganske narave.

Anaerobne vrste dihanja

Glavna naloga, ki jo rešuje anaerobna bakterija z respiratornim metabolizmom, je najti alternativo molekularnemu kisiku. Od tega je odvisen energetski izid reakcije. Glede na snov, ki deluje kot terminalni akceptor, obstajajo naslednje vrste anaerobne respiracije:

• nitrat;
• železo;
• fumarat;
• sulfat;
• žveplova;
• karbonata.

Anaerobna respiracija je manj učinkovita od aerobne respiracije, v primerjavi s fermentacijo pa daje veliko večji izpust energije.

Anaerobna destruktivna bakterijska skupnost

Ta vrsta mikrobiote se oblikuje v ekološko bogatih ekoloških nišah, v katerih se kisik skoraj povsem porabi (poplavljena tla, podzemni hidravlični sistemi, muljeviti sedimenti itd.). Tukaj je postopna razgradnja organskih spojin, ki jo izvajajo dve skupini bakterij:

• primarni anaerobi so odgovorni za prvo stopnjo organske de-stimulacije;
• sekundarni anaerobi so mikroorganizmi z dihalno presnovo.

Med primarnimi anaerobi ločimo hidrolize in disipotrofe, ki so med seboj povezani s trofičnimi interakcijami. Hidrolizi tvorijo biofilm na površini trdnih substratov in proizvajajo hidrolitične eksoenzime, ki razgrajujejo kompleksne organske spojine v oligomere in monomere.

Nastali hranilni substrat uporabljajo predvsem hidrolizi, pa tudi disipotrofi. Slednji so običajno manj kooperativni in ne oddajajo znatnih količin eksoenzimov, ki absorbirajo končne produkte hidrolize biopolimerov. Tipični predstavnik disipotrofov so bakterije iz rodu Syntrophomonas.

Gojenje

Posebne zahteve za gojenje veljajo le za obvezne anaerobne bakterije. Neobvezno dobro razmnoževanje v kisikovem okolju.

Metode gojenja anaerobnih mikroorganizmov spadajo v tri kategorije: kemična, fizikalna in biološka. Njihova glavna naloga je zmanjšati ali v celoti odpraviti prisotnost kisika v hranilnem mediju. Stopnja dovoljene koncentracije O ₂ je določena s tolerančno ravnjo določene anaerobne snovi.

Fizične metode

Bistvo fizikalnih metod je odstraniti kisik iz zraka, ki je v stiku s kulturo, ali popolnoma odstraniti stik bakterij z zrakom. Ta skupina vključuje naslednje tehnologije gojenja:

• gojenje v mikro aerostatu - posebna naprava, v kateri se namesto atmosferskega zraka tvori umetna mešanica plinov;
• globoko gojenje - sajenje bakterij ne na površini, temveč v visoki plasti ali v debelino medija, da zrak ne prodre tam;
• uporaba viskoznih medijev, v katerih se difuzija O ₂ zmanjšuje z naraščajočo gostoto;
• raste v anaerobni kozarec;
• polnjenje površine z vazelinskim oljem ali parafinom;
• uporaba inkubatorja CO ₂ ;
• uporaba anaerobne postaje SIMPLICITY 888 (najsodobnejša metoda).

Obvezen del fizikalnih metod je vrelišče hranilnega medija za odstranitev molekularnega kisika iz njega.

Uporaba kemikalij

Kemične spojine, ki se uporabljajo za gojenje anaerobov, so razdeljene v dve skupini:

• Čistilci kisika adsorbirajo molekule O _2. Absorpcijska zmogljivost je odvisna od vrste snovi in ​​prostornine zračnega prostora v okolju. Najpogosteje se uporabljajo pirogalol (alkalna raztopina), kovinsko železo, monovalentni bakrov klorid, natrijev ditionit.
• Reducirna sredstva (cistein, ditiotreitol, askorbinska kislina itd.) Zmanjšajo oksidacijsko-redukcijski potencial medija.

Posebna vrsta kemijskih metod je uporaba sistemov za generiranje plina, ki vključujejo sredstva, ki ustvarjajo vodik in ogljikov dioksid, in O2 absorbira paladijev katalizator. Takšni sistemi se uporabljajo v zaprtih posodah za gojenje (anaerostati, plastične vrečke itd.).

Biološke metode

Biološke metode vključujejo skupno gojenje anaerobov in aerobov. Slednji odstranjujejo kisik iz okolja in ustvarjajo pogoje za rast njihovih »partnerjev«. Kot sorbirajoča sredstva lahko uporabimo tudi neobvezne anaerobne bakterije.

Obstajata dve spremembi te metode:

• Setev dveh kultur na različnih polovicah petrijevke, ki se nato zapre s pokrovom.
• Setev z "opazovalnim steklom", ki vsebuje medij z aerobno bakterijo. Torej steklo pokrijemo petrijevko, neprekinjeno plast, ki se zaseje z anaerobno kulturo.

Včasih se v fazi priprave tekočega hranilnega medija za inokulacijo anaerobov uporabljajo aerobni mikroorganizmi. Po odstranitvi ostanka kisika se aerobi (npr. E. colli) ubijejo s segrevanjem in nato sejamo želeno kulturo.

Izolacija čiste kulture

Čista kultura je populacija mikroorganizmov, ki pripadajo isti vrsti in imajo enake lastnosti in so pridobljeni iz ene same celice. Za pridobitev skupine bakterij s takšnimi lastnostmi se običajno uporabljajo metode za redčenje in omejevalne razredčitve, vendar je delo z anaerobi poseben postopek, ki zahteva izločitev stika s kisikom pri pridobivanju izoliranih kolonij.

Obstaja več načinov za izolacijo čiste anaerobne kulture. Te vključujejo:

• Z Zeisslerjevo metodo se s petjem na petrijevke seji redčenje, pri čemer nastanejo anaerobni pogoji in kasnejša inkubacija v termostatu (od 24 do 72 ur).
• Weinbergova metoda - dodelitev anaerobov v kulturi s sladkornim agarjem (setev visok stolpec), bakterije prenesejo z zapečateno kapilaro. Najprej se material vstavi v epruveto z izotonično raztopino (korak redčenja), nato v epruveto z agarjem s temperaturo 40-45 stopinj, v kateri se temeljito premeša z medijem. Po tem izvedemo zaporedne prenose v še dve epruveti, od katerih se zadnja ohladi v toku vode.
• Peretzova metoda - material, razredčen v izotonični raztopini, se vlije v petrijevko, tako da zapolni prostor pod stekleno ploščo na njenem dnu, na katerem naj se začne rast.

Pri vseh treh metodah se material iz pridobljenih izoliranih kolonij prenese v medij za kontrolo sterilnosti (SCS) ali v medij Kitt-Tarozzi.